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CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理☁✘✘、方法及注意事項

釋出時間│₪: 2016-02-22  點選次數│₪: 3538次

一☁✘✘、CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理

Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)試劑可用於簡便而準確的細胞增殖和毒性分析◕│╃│•。其基本原理為│₪:該試劑中含有WST-8【化學名│₪:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】•₪,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazan dye)◕│╃│•。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比◕│╃│•。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析◕│╃│•。


用途│₪:藥物篩選☁✘✘、細胞增殖測定☁✘✘、細胞毒性測定☁✘✘、腫瘤藥敏試驗
 

CCK8的優點│₪:

  • 使用方便•₪,省去了洗滌細胞•₪,不需要放射性同位素和有機溶劑;
  • CCK-8法能快速檢測;
  • CCK-8法的檢測靈敏度很高•₪,甚至可以測定較低細胞密度;
  • CCK-8法的重複性優於MTT 法;
  • CCK-8法對細胞毒性小;
  • CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液•₪,毋需預製•₪,即開即用◕│╃│•。


CCK8的缺點│₪:

  • 與MTT法相 比•₪,CCK8和XTT的價格比較貴◕│╃│•。
  • CCK8試劑的顏色為淡紅色•₪,與含酚紅的培養基顏色接近•₪,不注意的話容易產生漏加或多加◕│╃│•。


與以往的增殖/毒性測定試劑相比較│₪:
 

檢測方法

MTT法

XTT法

WST-1法

CCK8法

甲臢產物的水溶性

差(需加有機溶劑溶解)

產品性狀

粉末

2瓶溶液

溶液

1瓶溶液

使用方法

配成溶液後使用

現配現用

即開即用

即開即用

檢測靈敏度

很高

很高

檢測時間

較長

較短

較短

zui短

檢測波長

560-600nm

420-480nm

420-480nm

430-490nm

細胞毒性

高•₪,細胞形態*消失

很低•₪,細胞形態不變

很低•₪,細胞形態不變

很低•₪,細胞形態不變

試劑穩定性

一般

較差

一般

很好

批次樣品檢測

可以

非常適合

非常適合

非常適合

便捷程度

一般

便捷

便捷

非常便捷


二☁✘✘、CCK8檢測細胞增殖/毒性的方法
實驗一│₪:細胞增殖分析

1☁✘✘、製備細胞懸液│₪:細胞計數

2☁✘✘、接種到96孔板中│₪:根據合適的鋪板細胞數•₪,每孔約100ul細胞懸液•₪,同樣的樣本可做3個重複◕│╃│•。

3☁✘✘、37℃培養箱中培養│₪:細胞接種後貼壁大約需要培養2-4小時•₪,如果不需要貼壁•₪,這步可以省去◕│╃│•。
4☁✘✘、加入10ul CCK8│₪:由於每孔加入CCK8量比較少•₪,有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差•₪,建議在加完試劑後輕輕敲擊培養板以幫助混勻◕│╃│•。或者直接配置含10%CCK8的培養基•₪,以換液的形式加入◕│╃│•。
5☁✘✘、培養1-4小時:細胞種類不同•₪,形成的Formazan的量也不一樣◕│╃│•。如果顯色不夠的話•₪,可以繼續培養•₪,以確認*條件◕│╃│•。特別是血液細胞形成的Formazan很少•₪,需要較長的顯色時間(5-6小時)◕│╃│•。

6☁✘✘、測定450nm吸光度│₪:建議採用雙波長進行測定•₪,檢測波長450-490nm•₪,參比波長600-650nm◕│╃│•。
 

實驗二│₪:細胞毒性分析
1☁✘✘、製備細胞懸液│₪:細胞計數

2☁✘✘、接種到96孔板中│₪:根據合適的鋪板細胞數•₪,每孔約100ul細胞懸液•₪,同樣的樣本可做3個重複◕│╃│•。

3☁✘✘、37℃培養箱中培養│₪:細胞接種後貼壁大約需要培養2-4小時•₪,如果不需要貼壁•₪,這步可以省去◕│╃│•。

4☁✘✘、加入不同濃度的毒性物質

5☁✘✘、37℃培養箱中培養│₪:加入毒性物質的培養時間•₪,要看毒性物質的性質和細胞的敏感性•₪,一般要根據細胞週期來決定•₪,起碼要一代以上的時間◕│╃│•。
6☁✘✘、加入10ul CCK8│₪:由於每孔加入CCK8量比較少•₪,有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差•₪,建議在加完試劑後輕輕敲擊培養板以幫助混勻◕│╃│•。
7☁✘✘、培養1-4小時:細胞種類不同•₪,形成的Formazan的量也不一樣◕│╃│•。如果顯色不夠的話•₪,可以繼續培養•₪,以確認*條件◕│╃│•。特別是血液細胞形成的Formazan很少•₪,需要較長的顯色時間(5-6小時)◕│╃│•。

8☁✘✘、測定450nm吸光度│₪:建議採用雙波長進行測定•₪,檢測波長450-490nm•₪,參比波長600-650nm◕│╃│•。


注│₪:

  • 若暫時不測定OD值•₪,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液•₪,並遮蓋培養板避光儲存在室溫條件下◕│╃│•。24小時內測定•₪,吸光度不會發生變化◕│╃│•。
  • 如果待測物質有氧化性或還原性的話•₪,可在加CCK8之前更換新鮮培養基(除去培養基•₪,並用培養基洗滌細胞兩次•₪,然後加入新的培養基)•₪,去掉藥物影響◕│╃│•。當然藥物影響比較小的情況下•₪,可以不更換培養基•₪,直接扣除培養基中加入藥物後的空白吸收即可◕│╃│•。

 

 

三☁✘✘、CCK8檢測細胞增殖/毒性的注意事項

 

  • 當使用標準96孔板時•₪,貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)◕│╃│•。檢測白細胞時的靈敏度相對較低•₪,因此推薦接種量不低於2,500 個/孔 (100 μl 培養基)◕│╃│•。
  • 酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾•₪,可以透過扣除空白孔中本底的吸光度而消去◕│╃│•。
  • CCK8可以檢測大腸桿菌•₪,但不能檢測酵母細胞◕│╃│•。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌汙染•₪,以免影響結果◕│╃│•。
  • CCK-8在0-5℃下能夠儲存至少6個月•₪,在-20℃下避光可以儲存1年◕│╃│•。
  • 當在培養箱內培養時•₪,培養板zui外一圈的孔zui容易乾燥揮發•₪,由於體積不準確而增加誤差◕│╃│•。一般情況下•₪,zui外一圈的孔只加培養基•₪,不作為測定孔用◕│╃│•。
  • 在培養基中加入CCK8•₪,培養一定的時間•₪,測定450 nm的吸光度即為空白對照◕│╃│•。在做加藥實驗時•₪,還應考慮藥物的吸收•₪,可在加入藥物的培養基中加入CCK8•₪,培養一定的時間•₪,測定450 nm的吸光度作為空白對照◕│╃│•。
  • 金屬對CCK-8顯色有影響│₪:當終濃度為1 mM的氯化亞鉛☁✘✘、氯化鐵☁✘✘、硫酸銅會抑制5%☁✘✘、15%☁✘✘、90%的顯色反應•₪,使靈敏度降級◕│╃│•。如果終濃度是10 mM的話•₪,將會100%抑制◕│╃│•。
  • 懸浮細胞由於染色比較困難•₪,一般需要增加細胞數量和延長培養時間◕│╃│•。
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