CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理☁✘✘、方法及注意事項

一☁✘✘、CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用於簡便而準確的細胞增殖和毒性分析◕│╃│•。其基本原理為│₪：該試劑中含有WST-8【化學名│₪：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】•₪，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）◕│╃│•。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比◕│╃│•。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析◕│╃│•。

用途│₪：藥物篩選☁✘✘、細胞增殖測定☁✘✘、細胞毒性測定☁✘✘、腫瘤藥敏試驗
 

CCK8的優點│₪：

• 使用方便•₪，省去了洗滌細胞•₪，不需要放射性同位素和有機溶劑；
• CCK-8法能快速檢測；
• CCK-8法的檢測靈敏度很高•₪，甚至可以測定較低細胞密度；
• CCK-8法的重複性優於MTT 法；
• CCK-8法對細胞毒性小；
• CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液•₪，毋需預製•₪，即開即用◕│╃│•。

CCK8的缺點│₪：

• 與MTT法相 比•₪，CCK8和XTT的價格比較貴◕│╃│•。
• CCK8試劑的顏色為淡紅色•₪，與含酚紅的培養基顏色接近•₪，不注意的話容易產生漏加或多加◕│╃│•。

與以往的增殖/毒性測定試劑相比較│₪：
 

二☁✘✘、CCK8檢測細胞增殖/毒性的方法
實驗一│₪：細胞增殖分析

1☁✘✘、製備細胞懸液│₪：細胞計數

2☁✘✘、接種到96孔板中│₪：根據合適的鋪板細胞數•₪，每孔約100ul細胞懸液•₪，同樣的樣本可做3個重複◕│╃│•。

3☁✘✘、37℃培養箱中培養│₪：細胞接種後貼壁大約需要培養2-4小時•₪，如果不需要貼壁•₪，這步可以省去◕│╃│•。
4☁✘✘、加入10ul CCK8│₪：由於每孔加入CCK8量比較少•₪，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差•₪，建議在加完試劑後輕輕敲擊培養板以幫助混勻◕│╃│•。或者直接配置含10%CCK8的培養基•₪，以換液的形式加入◕│╃│•。
5☁✘✘、培養1-4小時:細胞種類不同•₪，形成的Formazan的量也不一樣◕│╃│•。如果顯色不夠的話•₪，可以繼續培養•₪，以確認*條件◕│╃│•。特別是血液細胞形成的Formazan很少•₪，需要較長的顯色時間（5-6小時）◕│╃│•。

6☁✘✘、測定450nm吸光度│₪：建議採用雙波長進行測定•₪，檢測波長450-490nm•₪，參比波長600-650nm◕│╃│•。
 

實驗二│₪：細胞毒性分析
1☁✘✘、製備細胞懸液│₪：細胞計數

2☁✘✘、接種到96孔板中│₪：根據合適的鋪板細胞數•₪，每孔約100ul細胞懸液•₪，同樣的樣本可做3個重複◕│╃│•。

3☁✘✘、37℃培養箱中培養│₪：細胞接種後貼壁大約需要培養2-4小時•₪，如果不需要貼壁•₪，這步可以省去◕│╃│•。

4☁✘✘、加入不同濃度的毒性物質

5☁✘✘、37℃培養箱中培養│₪：加入毒性物質的培養時間•₪，要看毒性物質的性質和細胞的敏感性•₪，一般要根據細胞週期來決定•₪，起碼要一代以上的時間◕│╃│•。
6☁✘✘、加入10ul CCK8│₪：由於每孔加入CCK8量比較少•₪，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差•₪，建議在加完試劑後輕輕敲擊培養板以幫助混勻◕│╃│•。
7☁✘✘、培養1-4小時:細胞種類不同•₪，形成的Formazan的量也不一樣◕│╃│•。如果顯色不夠的話•₪，可以繼續培養•₪，以確認*條件◕│╃│•。特別是血液細胞形成的Formazan很少•₪，需要較長的顯色時間（5-6小時）◕│╃│•。

8☁✘✘、測定450nm吸光度│₪：建議採用雙波長進行測定•₪，檢測波長450-490nm•₪，參比波長600-650nm◕│╃│•。

注│₪：

• 若暫時不測定OD值•₪，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液•₪，並遮蓋培養板避光儲存在室溫條件下◕│╃│•。24小時內測定•₪，吸光度不會發生變化◕│╃│•。
• 如果待測物質有氧化性或還原性的話•₪，可在加CCK8之前更換新鮮培養基（除去培養基•₪，並用培養基洗滌細胞兩次•₪，然後加入新的培養基）•₪，去掉藥物影響◕│╃│•。當然藥物影響比較小的情況下•₪，可以不更換培養基•₪，直接扣除培養基中加入藥物後的空白吸收即可◕│╃│•。

三☁✘✘、CCK8檢測細胞增殖/毒性的注意事項

• 當使用標準96孔板時•₪，貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)◕│╃│•。檢測白細胞時的靈敏度相對較低•₪，因此推薦接種量不低於2,500 個/孔 (100 μl 培養基)◕│╃│•。
• 酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾•₪，可以透過扣除空白孔中本底的吸光度而消去◕│╃│•。
• CCK8可以檢測大腸桿菌•₪，但不能檢測酵母細胞◕│╃│•。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌汙染•₪，以免影響結果◕│╃│•。
• CCK-8在0-5℃下能夠儲存至少6個月•₪，在-20℃下避光可以儲存1年◕│╃│•。
• 當在培養箱內培養時•₪，培養板zui外一圈的孔zui容易乾燥揮發•₪，由於體積不準確而增加誤差◕│╃│•。一般情況下•₪，zui外一圈的孔只加培養基•₪，不作為測定孔用◕│╃│•。
• 在培養基中加入CCK8•₪，培養一定的時間•₪，測定450 nm的吸光度即為空白對照◕│╃│•。在做加藥實驗時•₪，還應考慮藥物的吸收•₪，可在加入藥物的培養基中加入CCK8•₪，培養一定的時間•₪，測定450 nm的吸光度作為空白對照◕│╃│•。
• 金屬對CCK-8顯色有影響│₪：當終濃度為1 mM的氯化亞鉛☁✘✘、氯化鐵☁✘✘、硫酸銅會抑制5%☁✘✘、15%☁✘✘、90%的顯色反應•₪，使靈敏度降級◕│╃│•。如果終濃度是10 mM的話•₪，將會100%抑制◕│╃│•。
• 懸浮細胞由於染色比較困難•₪，一般需要增加細胞數量和延長培養時間◕│╃│•。